ABI荧光定量PCR操作步骤
ABI 荧光定量仪基于实时荧光定量 PCR（Polymerase Chain Reaction，聚合酶链式反应）技术。在 PCR 扩增过程中，随着特定荧光染料与扩增产物结合，荧光信号强度会伴随产物数量的增加而增强。仪器通过实时监测荧光信号，依据荧光信号达到设定阈值时的循环数（Ct 值），精准推算出初始模板的含量。为读者全面呈现这一先进仪器的魅力。以下是ABI荧光定量PCR的一般操作步骤：
- 准备工作：设计并合成引物和探针（若为探针法），准备好模板DNA、荧光定量PCR试剂、无菌水、离心管、移液器等实验器材。
- 开机与软件启动：先开电脑，再开仪器，最后打开软件。
- 实验设置
– 双击桌面图标，进入主界面后选择“advanced setup”。
– 默认进入“setup”下的“experiment properties”界面，输入实验名称，确认仪器型号，在实验类型中，选择“quantitation – comparative ct（△△ct）”等，选择试剂种类（如探针法或染料法）。
- 编辑基因及样本
– 进入“setup”下的“plate setup”界面，在“define targets and samples”界面中设置基因及样品。利用“add new target”添加新的基因，并在“target name”中编辑基因名称，若是SYBR Green法，默认FAM通道即可；若是探针法，需在“reporter”和“quencher”中选择所标记的荧光基团及淬灭基团。还可利用相关按钮保存或删除已添加的基因。利用“add new target”添加新的样本，并编辑样品名称。
– 在“assign targets and samples”界面中进行样品板的排布。利用鼠标单击或拖拽以选择反应孔，然后勾选左侧的基因及样本，同时在“task”选项中指定该反应孔类型（U代表未知样本，N代表阴性对照，P代表阳性对照）。 – 在“select relative quantitation setting”中设置内参基因及对照样本。
- 设定反应条件及体积：进入“run method”界面，更改温度及时间，确认所示图标为点亮状态，以保证信号正常采集。根据所使用的试剂和引物等优化反应条件，包括变性、退火、延伸的温度和时间等。
- 保存并运行实验：点击“save”，将文件储存成“experiment document single files（*.eds）”格式，然后在“run”界面按下“start run”按钮，反应即开始进行。
- 结果分析
– 实验结束后，点击界面右上角的“analyze”按钮，软件将会显示实验结果。 – 在扩增图中，可通过更改“plot settings”来改变扩增图的显示方式。如果想查看阈值线或基线，请将“threshold”及“baseline”打勾。
– 查看相对表达量结果时，利用“plot settings”选项，可以以不同方式显示相对表达量的结果。
– 对于SYBR Green法实验，可以在“melt curve”界面中查看熔解曲线，帮助确定产物类型，判断是否有非特异性扩增。
– 检测“qc summary”结果，可以快速查看实验中是否有反应孔存在异常情况。黄色三角形中的数字代表异常情况的种数，详细信息及解决方案可以在“flag details”中看到。
8. 数据导出与保存：分析之后的结果，可以利用菜单中的“file > export”功能，导出Excel格式的结果。若想存储图片结果，可直接在图片上单击鼠标右键，选择“save as”，存成JPEG格式的图片，也可以直接按相机图标保存。