PCR常见问题及解决方案 点击次数：1785 发布日期：2014-9-8 来源：本站 仅供参考，谢绝转载，否则责任自负 问题 可能原因 解决方法 无产物或产量低 模板浓度偏低或偏高 电泳检测模板浓度，调...
PCR常见问题及解决方案 点击次数：1785 发布日期：2014-9-8 来源：本站 仅供参考，谢绝转载，否则责任自负
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问题
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可能原因
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解决方法
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无产物或产量低
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模板浓度偏低或偏高
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电泳检测模板浓度，调整模板用量
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模板降解
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重新制备；基因组DNA、cDNA应小量分装后低温保存
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模板中含有抑制反应的杂质
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纯化模板
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引物浓度不足
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调整引物浓度，特别是针对长片段PCR
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引物存在二级结构
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重新设计引物，避免二级结构；优化退火温度
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引物降解
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引物应高浓度小量分装，-20℃保存，避免反复冻融
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Mg2+浓度偏低
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适当提高Mg2+浓度，从1 mM到3 mM以0.5 mM间隔递增，针对不同模板和引物摸索最佳Mg2+浓度
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dNTP降解
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-20℃保存，小量分装，避免反复冻融
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酶纯度低，扩增效率差
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选用高质量DNA聚合酶
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酶量不足
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适当增加酶量
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用酶不当
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针对模板、目标片段的特选择适当的酶(详见PCR产品选择指南)
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缓冲液失效
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更换缓冲液或使用预混PCR反应体系
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模板变性不充分
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适当延长变性时间；对高GC或复杂结构模板，提高起始变性温度至98℃
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退火温度偏高
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降低退火温度，应比引物Tm低至少5℃
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延伸时间不足
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增加延伸时间，特别是针对长片段PCR
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循环数目不够
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增加循环数
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PCR管污染
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质量可靠的PCR管通常不需灭菌，否则应先高温高压灭菌处理；用过的PCR管不可清洗后重复使用
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PCR仪故障
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检查程序和模块温度
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其他
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使用PCR增强剂
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非特异产物过多
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体系污染
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设计对照实验寻找污染源，操作时应注意避免交叉污染
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引物浓度过高
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适当减少引物浓度
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引物序列特异性差
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重新设计引物
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Mg2+浓度过高
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降低Mg2+浓度，从1 mM到3 mM以0.5 mM间隔递增，针对不同模板和引物摸索最佳Mg2+浓度
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dNTP浓度过高
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降低dNTP浓度
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酶量过多
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减少酶量，以0.5 U间隔递减
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退火温度过低
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提高退火温度
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延伸时间过短
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增加延伸时间，以1 min间隔递增
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循环次数过多
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减少循环次数
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模板结构过于复杂或目标片段过长
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特选择适当的酶(详见PCR产品选择指南)；使用PCR增强剂
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其他
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HotStart PCR
TouchDown PCR
巢式PCR
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引物二聚体
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引物3’末端存在互补序列
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重新设计引物
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引物浓度过高
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降低引物浓度
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模板浓度过低
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提高模板浓度
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退火温度不合适
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优化退火温度
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循环次数过多
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减少循环次数
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其他
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HotStart PCR
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拖尾严重
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引物浓度过高
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调整引物浓度
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引物序列特异性差或模板上存在同源序列
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重新设计引物
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模板降解
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重新制备模板
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模板浓度过高
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降低模板浓度
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dNTP浓度过高
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减少dNTP用量
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Mg2+浓度过高
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降低Mg2+浓度，从1 mM到3 mM以0.5 mM间隔递增，针对不同模板和引物摸索最佳Mg2+浓度
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酶量过多或质量差
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减少酶量，以0.5 U间隔递减；更换质量可靠的酶
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变性温度过低
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提高变性温度，以0.5℃递增
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退火温度过低
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提高退火温度
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延伸时间过长
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缩短延伸时间
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循环次数过多
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减少循环次数，以2个循环间隔递减
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体系污染
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设计对照实验，消除污染源
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其他
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HotStart PCR
TouchDown PCR
巢式PCR
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假阳性
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目标片段与非特异扩增片段间存在同源性
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设计阴性对照，确认为引物问题后重新设计引物
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体系污染
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设计阴性对照判断是否有污染，去除污染源
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